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2025年09月26日 10:32 来源：
FITC 与羟基脯氨酸通过异硫氰酸酯 - 氨基特异性反应实现结合，反应温和且专一，全程不破坏双方核心功能，具体过程分 3 步：
反应位点匹配羟基脯氨酸的亚氨基（-NH-）中，氮原子具有亲核性（可提供电子）；FITC 的异硫氰酸酯基团（-NCS）中，碳原子因受氮、硫原子电负性影响，呈缺电子状态 —— 两者可通过 “亲核攻击” 发生特异性反应，且该反应仅针对含活泼氢的氨基 / 亚氨基，不与羟基、羧基反应，确保结合位点精准。
反应条件控制反应需在中性至弱碱性缓冲液（如 pH 7.2-8.0 的 Tris-HCl 缓冲液）中进行：
酸性环境会导致 FITC 的 - NCS 基团水解失效，无法与羟基脯氨酸反应；
强碱性环境会破坏羟基脯氨酸的吡咯烷环结构，导致其失去生物活性；
室温搅拌反应 12-24 小时，可确保反应充分，同时避免高温导致 FITC 荧光淬灭。
产物形成与纯化
反应过程中，FITC 的 - NCS 基团与羟基脯氨酸的 - NH - 反应，脱去小分子副产物，形成 “羟基脯氨酸 - NH-CS-NH-FITC” 的共价结构，即 FITC - 羟基脯氨酸。
反应结束后，通过 “凝胶过滤层析” 去除未反应的游离 FITC 和羟基脯氨酸：游离 FITC 会产生非特异性荧光，干扰后续实验；未反应的羟基脯氨酸会影响标记物的纯度，需彻底去除，最终得到高纯度的荧光标记物。
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